羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.51.015

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (51): 8875-8880.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.51.015

• 材料生物相容性 material biocompatibility • 上一篇下一篇

羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的生物相容性

马骁¹，石红¹，黄一飞²，黄靖香²，崔福斋³

¹北京世纪坛医院眼科，北京市 100038；²解放军总医院眼科，北京市 100853；³清华大学材料科学工程系，北京市 100084

出版日期:2013-12-17 发布日期:2013-12-17
通讯作者: 黄一飞，解放军总医院眼科，北京市 100853 mxia-010@163.com
作者简介:马骁☆，女，1978年生，内蒙古自治区通辽市人，汉族，2007年解放军总医院毕业，博士，主治医师，主要从事角膜及眼表疾病的基础和临床工作。
基金资助:
解放军十五课题(01MA109)*；解放军十一五课题(06MA281)*

Biocompatibility of hydroxyapatite modified titanium skirt for keratoprosthesis

Ma Xiao¹, Shi Hong¹, Huang Yi-fei², Huang Jing-xiang², Cui Fu-zhai³

¹ Department of Ophthalmology, Hospital of Shijitan, Beijing 100038, China; ²Department of Ophthalmology, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China; ³Department of Materials Science and Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Online:2013-12-17 Published:2013-12-17
Contact: Huang Yi-fei, Department of Ophthalmology, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China mxia-010@163.com
About author:Ma Xiao☆, M.D., Attending physician, Department of Ophthalmology, Hospital of Shijitan, Beijing 100038, China
Supported by:
the Tenth Five-Year Projects of Chinese PLA, No. 01MA109*; the Eleventh Five-Year Projects of Chinese PLA, No. 06MA281*

摘要/Abstract

摘要：

背景：纯钛作为安全的生物种植体材料已被用于制作俄罗斯钛人工角膜，但其临床使用中仍存在人工角膜移位、漏水、角膜组织融解或人工角膜排出等并发症。
目的：观察经羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架在碱烧伤兔角膜内的生物相容性。
方法：将30只右眼角膜碱烧伤新西兰白兔随机分为3组，实验组于角膜基质层内植入经羟基磷灰石表面修饰的人工角膜钛支架，对照组于角膜基质层内植入人工角膜钛支架，空白对照组仅作角膜板层切口。
结果与结论：所有支架在观察期内稳定存留，无角膜坏死融解及支架脱出发生。术后2，8周，实验组与对照组炎症细胞浸润数量明显高于空白对照组(P < 0.05)，16周后各组间炎症细胞浸润数量差异无显著性意义。术后2，8，16周，实验组角膜成纤维细胞数高于对照组和空白对照组(P < 0.05)。实验组支架表面有密集的角膜细胞及细胞外基质紧密抓附，支架与角膜组织愈合良好；对照组支架表面仅见少量角膜组织简单包裹，支架与角膜组织未真正愈合。表明羟基磷灰石表面修饰的人工角膜钛支架可在碱烧伤兔角膜组织中稳定存留，生物相容性较单纯钛支架提高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

关键词: 生物材料, 材料生物相容性, 人工角膜, 羟基磷灰石, 钛, 表面修饰, 碱烧伤, 生物相容性, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: Titanium implants as a safe biological material have been used to produce the artificial Russian titanium cornea, but complications still exist, including artificial cornea shift, leakage, corneal tissue melting and artificial cornea discharge.
OBJECTIVE: To evaluate in vivo biocompatibility of hydroxyapatite modified titanium skirt for keratoprosthesis in alkali burn cornea.
METHODS: A total of 30 alkali burned New Zealand white rabbit corneas were divided into three group groups. Hydroxyapatite modified titanium skirt (experimental group) and titanium skirt (control group) were respectively inserted into the corneal stroma of rabbits. In the blank control group, only a lamellar corneal incision was made.
RESULTS AND CONCLUSION: All skirts were stable without necrosis, melting and exclusion during the observation period. The number of inflammatory cells in the experimental and control groups was significantly higher than that in the blank control group at 2 and 8 weeks postoperatively (P < 0.05), but there was no difference in inflammatory cell infiltration among different groups by the 16th week. The number of corneal fibroblasts increased significantly in the experimental group compared with the control and blank control group after 2, 8, 16 weeks (P < 0.05). The extracellular matrix deposited on the surface of hydroxyapatite modified titanium skirt was denser and tighter than that on the surface of titanium skirt. It indicates that hydroxyapatite modified titanium skirt for keratoprosthesis can promote the

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

interfacial biointegration of skirt and host cornea.

Key words: biocompatible materials, hydroxyapatites, titanium, cornea, stents

中图分类号:

R318

马骁，石红，黄一飞，黄靖香，崔福斋. 羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(51): 8875-8880.

Ma Xiao, Shi Hong, Huang Yi-fei, Huang Jing-xiang, Cui Fu-zhai . Biocompatibility of hydroxyapatite modified titanium skirt for keratoprosthesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(51): 8875-8880.

图/表（结果） 8

2.1 兔角膜碱烧伤模型 角膜碱烧伤后3 d内，炎症反应最强烈，角膜上皮缺损、基质水肿，7 d后炎症反应开始减退，角膜缘充血减轻但新生血管增加。3个月后，所有动物形成了角膜白斑和新生血管。

组织学检查：苏木精-伊红染色见再生的角膜上皮厚薄不均，角膜基质排列不规则，基质内可见新生血管，有多形核白细胞和巨噬细胞浸润，亦有一定数量的纤维母细胞及成纤维细胞存在，见图1，表明碱烧伤造成的炎症反应已减轻，角膜从炎症反应状态转向组织修复过程。

2.2 人工角膜钛支架植入后的临床观察 术后7 d内出现不同程度的畏光、流泪、分泌物增多，7 d后症状消失。观察期内支架均稳定存留，无角膜溃疡、坏死融解及支架脱出发生，见图2。

2.3 组织学检查结果 实验组、对照组采用塑料包埋，切片过程中钛支架全部脱落，在角膜基质内留下一空腔，但钛表面的羟基磷灰石涂层仍保留在原位。支架脱落处的组织界面光滑，形态保存好。术后2周可见角膜组织界面处大量炎症细胞浸润，主要为嗜酸性粒细胞和巨噬细胞，后随时间逐渐减少，见图3。

各组炎症细胞计数结果显示，术后2，8 周，实验组与对照组炎症反应程度相近，均明显高于空白对照组(P < 0.05)，但16周后3组间炎症反应无明显差异 (P > 0.05)，见图4。

术后2周组织界面处即可见角膜成纤维细胞增殖，术后2，8，16周角膜成纤维细胞计数结果显示，实验组角膜成纤维细胞增殖最显著，明显高于对照组和空白对照组(P < 0.05)，见图5。

人工角膜支架：扫描电镜见纯钛支架表面平整光滑，见图6；经酸碱法预处理后钛表面产生的羟基磷灰石涂层由两层结构组成，外层为疏松的片状羟基磷灰石结晶，内层为羟基磷灰石密集层, 估计羟基磷灰石涂层厚度约为30 μm，见图7。

角膜层间取出的人工角膜支架：术后6周，钛支架表面可见细胞及细胞外基质附着，但数量少并呈简单贴附生长；术后12周，钛支架表面细胞数目减少，支架表面仍大部分呈裸露状态，局部区域可见少量角膜组织包裹钛支架，钛/角膜界面未真正愈合，见图8，9。术后6周，羟基磷灰石涂层钛支架表面可见角膜成纤维细胞跨越羟基磷灰石微孔表面向孔内生长，角膜组织呈爬行生长并连接成片；12周后羟基磷灰石涂层钛支架表面大部分被密集的角膜细胞外基质及细胞紧密抓附覆盖，羟基磷灰石涂层钛/角膜界面粘连紧密，愈合良好，见图10，11。

参考文献

[1]黄一飞,王丽强,王凤翔.人工角膜植入术的临床研究[J].中华眼科杂志,2003, 39(10):9-12.

[2]Huang YF,Yu JF,Liu L,et al.Moscow Eye Microsurgery Complex in Russia Keratoprosthesis in Beijing. Ophthalmology. 2011;118(1):41-46.

[3]Dong Y,Huang YF,Wang LQ,et al.Long-term outcomes of MICOF keratoprosthesis in the end stage of autoimmune dry eyes: an experience in China.Br J Ophthalmol.2012;96:28-33.

[4]Kasemo B.Biological surface science.Surface Science.2002; 500:656- 677.

[5]Puleo DA,Nanci A.Understanding and controlling the bone}implant interface. Biomaterials.1999;20:2311-2321.

[6]Wen HB,Liu Q,De Wijn JR,et al.Preparation of bioactive microporous titanium surface by a new two-step chemical treatment.J Mater Sci Mater Med.1998; 9(3):121-128.

[7]Ilhan-Sarac O.Akpek EK.Current concepts and techniques in keratoprosthesis. Curr Opin Ophthalmol.2005;16(4):246-250.

[8]Sandeman SR,Lloyd AW,Tighe BJ,et al.A model for the preliminary biological screening of potential keratoprosthetic biomaterials.Biomaterials.2003; 24(26):4729-4739.

[9]Stoiber J,Forstner R,Csáky D,et al.Evaluation of Bone Reduction in Osteo-Odontokeratoprosthesis (OOKP) by three dimensional Computed Tomography.Cornea.2003;22(2):126-130.

[10]Ma X,Li ZH,Huang YF,et al.Hydroxyapatite modified titanium promotes superior adhension and proliferation of corneal fibroblast in comparison with pure titanium.Int J Ophthalmol. 2007;7(1):6-9.

[11]Sandeman SR,Lloyd AW,Tighe BJ,et al.A model for the preliminary biological screening of potential keratoprosthetic biomaterials.Biomaterials.2003; 24(26):4729-4739.

[12]Marques AP,Reis RL,Hunt JA.The biocompatibility of novel starchbased polymers and composites: In vivo studies. Biomaterials.2002;23(6):1471-1478.

[13]Pu FR,Williams RL,Markkula TK,et al.Expression of leukocyte-endothelial cell adhesion molecules on monocyte adhesion to human endothelial cells on plasma treated PET and PTFE in vitro.Biomaterials.2002;23:4705-4718.

[14]Linnola RJ,Happonen RP,Andersson OH,et al.Titanium and bioactive glass-ceramic coated titanium as materials for keratoprosthesis.Exp Eye Res.1996;63:471-478.

[15]Sletteberg O,Hovding G,Bertelsen T.Keratoprosthesis. I. Results obtained after implantation of 12 one-piece prostheses. A retrospective, follow-up study.Acta Ophthalmol Copenh.1990;68:369-374.

[16]Zhao J,Lu X,Duan K,et al.Improving mechanical and biological properties of macroporous HA scaffolds through composite coatings.Colloids Surf B Biointerfaces.2009;74(1): 159-166.

[17]Hicks CR,Vijayasekaran S,Chirila TV,et al.Implantation of PHEMA keratoprostheses after alkali burns in rabbit eyes. Cornea.1998; 17(3):301-308.

引言

材料方法

设计：以新西兰白兔为实验对象，随机对照实验。

时间及地点：实验于2010年11月至2012年2月在解放军总医院眼科实验室完成。

材料：

实验动物：实验选用6月龄健康雌性新西兰白兔33只，体质量2.5-3.0 kg，由解放军总医院动物实验室提供，合格证号SCXK-2006，普通级。

实验方法：

兔角膜碱烧伤模型的建立：33只新西兰白兔经速眠新Ⅱ号肌注(0.3 mL/kg)麻醉后，置开睑器，用直径为9 mm圆形滤纸片蘸取1 mol/L氢氧化钠溶液，密切贴附于兔右侧角膜正中并避开睑、球结膜，30 s后取下，大量生理盐水迅速冲洗角膜和结膜囊1 min。术后10 d每日以0.5%金霉素眼膏涂眼，3个月后取3只白兔角膜行组织病理学检查，其余30只进入人工角膜支架植入实验。

人工角膜支架植入：将30只新西兰白兔随机分为3组，每组10只。实验组植入羟基磷灰石表面修饰的人工角膜钛支架，对照组植入人工角膜钛支架，空白对照组为手术对照组。

手术方法：速眠新Ⅱ号(0.3 mL/kg)肌注麻醉白兔，在眼科手术显微镜下于右眼角膜缘内2 mm处做平行角膜缘的角膜板层切口，长6 mm，深为角膜全层的1/2-2/3；以角膜板层刀分离角膜板层制成直径约8 mm的角膜板层口袋，并尽量使其位于角膜中央。实验组和对照组于角膜板层口袋内分别植入羟基磷灰石表面修饰的人工角膜钛支架和人工角膜钛支架，空白对照组仅作角膜板层口袋，不植入人工角膜支架，作为手术对照组。角膜切口以10-0尼龙线间断缝合两针。术后给予0.5%金霉素眼膏连续涂眼3 d。1周内每日裂隙灯下观察角膜反应情况，之后改为每周3次。7 d后拆除角膜缝线。

组织病理学检查：术后2，8，16周每组每个时间点各取2只兔，速眠新Ⅱ号肌注麻醉后，在手术显微镜下沿角膜缘剪下角膜，置40 g/L多聚甲醛(pH值7.2，4 ℃，现配)固定2 h，角膜内植入支架者使用塑料包埋法，无支架者选用石蜡包埋，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察支架与角膜组织界面愈合情况，200倍视野下任选10个等大的区域，计数各组炎症细胞数量和角膜成纤维细胞数量。

扫描电子显微镜检查：术后6，12周，实验组和对照组每个时间点各取2只兔，速眠新Ⅱ号肌注麻醉后，在手术显微镜下沿支架边缘作角膜切口，板层刀分离支架周围的角膜组织，取出支架，PBS漂洗后，2.5%戊二醛固定，PBS漂洗，1%锇酸4 ℃下固定1.0-2.0 h，梯度丙酮脱水，乙酸异戊酯替代，室温下六甲基二硅胺烷(HMDS)干燥，喷金，日立S-2250N扫描电子显微镜观察和摄片。

主要观察指标： ①兔角膜碱烧伤3个月后模型的组织病理学检查。②观察人工角膜支架植入兔角膜层间后界面的生物愈合情况。③扫描电镜观察角膜内人工角膜支架取出后，其表面角膜组织的生长情况。

统计学分析：实验数据由第二作者采用SPSS 16.0统计软件包进行分析，数据用x(_)±s表示，组间比较用方差分析和q 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

讨论

对于严重的角膜疾病如Stevens-Johnson 综合征、眼瘢痕性类天疱疮、严重的眼化学烧伤等导致的双眼盲患者，人工角膜是其最终复明的希望，但以往临床中使用的人工角膜材料，如合金、PMMA、PHEMA、PTFE等，生物活性差，与宿主角膜的结合多是简单的黏附，因而人工角膜难以在眼内长期稳定的存留^[7] 。调节材料的生物活性使其能与角膜牢固结合融为一体已成为人工角膜进一步发展的方向^[8] 。
目前最成功的人工角膜是以患者牙齿作为支架材料的OOKP人工角膜，但OOKP手术周期长，需损耗患者牙齿，而且长期使用中存在着骨质支架吸收问题^[9] 。实验将骨质中的主要活性成分羟基磷灰石通过酸碱两步法沉积在钛支架表面改变其生物活性，并已在体外实验中证实钛支架经羟基磷灰石表面修饰后，其促角膜成纤维细胞黏附、增殖生长及分化的能力均有提高^[10] 。在此研究基础上，作者进一步进行了体内实验，将羟基磷灰石-钛和钛支架分别植入碱烧伤新西兰白兔角膜层间，结果发现羟基磷灰石-钛与角膜组织的界面愈合情况明显优于纯钛支架。羟基磷灰石表面修饰法促进了支架材料与宿主角膜的生物整合。
对宿主而言，生物材料植入体内后引发的最普遍反应就是炎症反应，包括早期宿主对手术损伤的修复反应及晚期植入材料诱导的宿主异物反应^[11] 。生物材料的理化特性及表面特性将直接影响炎症反应的进程，而炎症反应的程度和持续时间又将反过来影响到生物材料的稳定性^{[12-13 ]} 。实验发现术后2周和8周时，羟基磷灰石-钛或钛支架界面炎症反应较轻、程度相近，并随时间炎症反应逐渐减弱，说明羟基磷灰石-钛和钛一样，均为安全的种植体，其引发的炎症反应可被宿主接受，不引起排斥，这与Linnola等^[14]的研究结果一致。
作者研究发现，虽然两种支架植入角膜后均能促进角膜成纤维细胞的增生及细胞外基质的沉积，但各个观察时间点，羟基磷灰石-钛组角膜成纤维细胞的数目均多于钛支架组，而且两组细胞外基质沉积的形式不同，在钛支架组宿主角膜的胶原纤维平行环绕于钛支架表面，扫描电镜证实这些环绕的角膜组织与钛表面的结合仅是简单的贴附。与钛作为口腔种植体时，牙龈纤维与钛的结合情况相似。这种简单的附着在眼睑和眼球运动等外力作用下将可能发生分离，因此MICOF人工角膜临床使用中存在移位、漏水等并发症。与钛/角膜界面不同，在羟基磷灰石-钛支架组，角膜成纤维细胞跨越羟基磷灰石微孔表面向孔内生长，羟基磷灰石-钛支架表面大部分被密集的角膜细胞外基质及细胞紧密抓附，羟基磷灰石-钛/角膜组织界面愈合良好，Slettebery等^[15]发现将生物陶瓷从体内排出的难度是钛排出的10倍，其原因即是生物陶瓷与体液接触后在其表面形成了一薄层羟基磷灰石，从而限制了其排出。
羟基磷灰石是目前公认的较好的生物相容性材料，其可促进软/硬组织间的生物整合，但纯羟基磷灰石脆性大、质硬、可塑性差^[16] ，单独作为人工角膜支架时无法承受眨眼时眼睑对角膜的加压，易发生碎裂。将羟基磷灰石涂覆到钛支架表面制成复合材料，可使其兼有羟基磷灰石的生物活性和金属较强的力学性能，为临床改良MICOF人工角膜提供了新方法。
临床中人工角膜的适应证是严重血管化及长期存在慢性炎症的病变角膜，在这些角膜中角膜成纤维细胞增生及胶原沉积能力均不足^[17] 。实验中建立中度兔角膜碱烧伤模型，烧伤后不给予任何抗炎及抗胶原酶药物治疗，以使损伤更大化，并选择于碱烧伤3个月后植入羟基磷灰石/钛和钛支架，因为此时兔角膜仍处于炎症反应期，角膜成纤维细胞少，组织愈合功能差，可较好地模拟临床实际情况，使实验更具意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
全文链接：

羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的生物相容性

Biocompatibility of hydroxyapatite modified titanium skirt for keratoprosthesis

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王刚, 李东辉, 白志明. 长段输尿管损伤替代治疗的方法、材料及修复重建的演变历程[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1299-1305.
[2]	张圣敏, 刘超. 生物支架材料诱导脂肪来源干细胞成骨分化的最新热点[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1107-1116.
[3]	刘春栋, 申晓青, 张艳丽, 张小根, 吴补领. 钛表面锶改性后骨髓基质干细胞黏附、迁移、增殖及成骨相关基因的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1009-1015.
[4]	李黎, 马力, 李鹤. 磁性壳聚糖微球的制备及表征[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 577-582.
[5]	唐萌萌, 陈和春, 谢宏晨, 张瑜, 谭晓霜, 孙艺璇, 黄毅娜. 聚(L-丙交酯-ε-己内酯)/交联聚乙烯吡咯烷酮输尿管支架植入大鼠膀胱后的组织相容性[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 583-588.
[6]	胡超然, 邱冰, 周祝兴, 杨洋, 李佳. 3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合支架与骨髓间充质干细胞的体外生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 589-595.
[7]	张亚楠, 严霞, 孟增东. Zn、Mg增强羟基磷灰石骨修复材料临床应用与机制：生物活性及成骨诱导的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 606-611.
[8]	汤井沣, 张骏, 尤奇, 刘毅. 在软骨修复中应用石墨烯及其衍生物相关复合材料的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 619-624.
[9]	刘海燕, 胡阳, 武秀萍, 潘浩波, 荆璇. 壳聚糖基多糖材料防治口腔疾病的作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 631-636.
[10]	张辉, 徐南伟, 农鲁明, 汤雪明, 周鑫叠, 蒋巍. 颈脊髓中央管综合征钛板内固定和药物治疗的预后因素分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(3): 348-353.
[11]	辛鹏飞, 孙友强, 李杰, 陈建发, 邓宝贵, 向孝兵. 生物材料修复肩袖损伤的最新研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(28): 4459-4464.
[12]	刘艳华, 朱舟, 万乾炳. 静电纺丝伤口修复载药体系：组分的选择及构建策略[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(28): 4465-4473.
[13]	郭恩慧, 许子桐, 梁贻泽, 周亮, 鲁召翔, 尤梁, 夏玉军. 一种新型光交联鱼胶原蛋白肽-透明质酸水凝胶的性能表征[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(28): 4518-4525.
[14]	刘飞, 张冠鑫, 刘晓红, 王立成, 徐志云. 灭菌处理牛心包制备脱细胞支架的内皮化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(28): 4562-4566.
[15]	马超, 王辉山, 韩劲松, 尹宗涛, 张锡祾. 心脏瓣膜假体植入和外科消融迷宫手术治疗瓣膜病合并心房颤动[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(28): 4580-4587.